与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，差异有显著性。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，差异有显著性;正义组、错义组无明显差异。见表1。

2.3 各组TH mRNA表达原位杂交检测结果及其(ISH)比较

与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH阳性细胞数显著减少，反义组未见减少。与PD组比较，反义组TH阳性细胞数显著增多，正义组、错义组无明显差异。说明PD时TH的表达减少，Synphilin?1反义寡核苷酸阻断能够提高TH的表达。见表1。表1 各组TH免疫组化和原位杂交阳性细胞计数及其比较与正常对照组比较, F=5.984 、13.188，*q=6.25～8.20,P<0.01; 与PD组比较， △q=4.13, P<0.05 ; △△ q=5.77, P<0.01

2.4 各组TH蛋白表达Western blot半定量检测结果比较 正常对照组、PD组、反义组、正义组、错义组TH蛋白半定量检测结果分别为902.51±62.93、614.13±57.58、980.83±102.28、730.13±90.52、584.65±88.36，与正常对照组比较，PD组、正义组和错义组TH表达量显著减少，差异有显著性(F=13.556，q=3.63～6.70,P<0.05、0.01);反义组差异无显著性。与PD组比较，反义组TH表达量显著增多(q=4.13, P<0.01)，正义组、错义组无显著差异。

3 讨 论

ENGELENDER等[4]于1999年在筛选α?synuclein蛋白相互作用物时发现，在LB中有一蛋白与α?synuclein蛋白相互作用，命名为Synphilin?1。研究表明，PD病人α?synuclein蛋白在脑内异常聚集，并形成PD特征性的病理表现LB的主要成分，由此认为该蛋白在PD的发病机制中具有重要意义[6]。因此，研究与α?synuclein蛋白相互作用的蛋白synphilin?1表达，对于研究PD的发病机制具有重要意义。本研究利用免疫组化法研究显示，PD组黑质Synphilin?1阳性神经元数比正常组明显增多，提示6?OHDA可能通过促进该蛋白的高表达而导致多巴胺神经元死亡，推测Synphilin?1参与PD的发病机制，但具体作用机制有待深入的研究。

TH是DA合成的限速酶，TH的增加和减少直接影响着DA的含量。许多研究已经证明，PD时TH明显减少。本研究利用免疫组化法及Western blot定量检测显示，PD组TH的表达明显下降，与相关文献报道一致[7～9];原位杂交检测显示TH mRNA的表达在PD组明显下降，说明TH在分子水平就有改变，进一步证明TH下降导致DA含量下降，从而导致PD症状的出现。然而，Synphilin?1蛋白的高表达与TH是否有关，以及Synphilin?1在6?OHDA 诱导的PD发病机制中的作用是否与TH有关有待进一步研究。

反义寡核苷酸通过序列特异地与靶mRNA结合而抑制基因表达, 从而成为一类理想的、基因水平调控的治疗药物[10]。因具有较好的抗酶解活性,寡核苷酸硫代磷酸酯已成为目前最广泛研究的寡核苷酸类似物之一,并已应用于临床[11]。本文设计了正义、错义、反义3种寡核苷酸，注入大鼠右侧黑质，然后再在黑质内注入6?OHDA，分别应用免疫组化、Western blot、原位杂交法检测TH阳性细胞数，结果显示，与PD组比较，反义组术侧黑质的TH阳性细胞数显著增多，蛋白显著增多，mRNA表达阳性细胞数也显著增多，而正义组、错义组与PD组比较差异无显著性，说明PD模型黑质Synphilin?1高表达的抑制，可以提高TH蛋白的表达，进一步说明Synphilin?1反义寡核苷酸能够抑制PD黑质神经元的损伤;另一方面说明了Synphilin?1对PD的作用机制之一可能是通过减少TH的表达来实现的。由此我们认为它与α?synuclein相互作用共同参与了PD的发病机制。

【参考文献】

[1]SPILLANTINI M G, SCHMIDT M L, LEE V M, et al. α?synuclein in Lewy bodies[J]. Nature, 1997,388(6645):839?840.

[2]POLYMEROPOLOS M H, LAVEDAN C, LEROY E, et al. Mutation in the alpha?synuclein gene identified in families with Parkinson?s disease[J]. Science, 1997,276 (5321):2045?2047.

[3]KRUGER R, KUHN W, MULLER T, et al. Ala 39 Pro mutation in the gene encoding α?synuclein in Parkinson?s disease[J]. Nature Genet, 1998,18(2):106?108.

[4]ENGELENDER S, KAMINSKY Z, GUO X, et al. Synphilin?1 associates with alpha?synuclein and promotes the formation of cytosolic inclusions[J]. Nat Genet, 1999, 22(1):110?114.

[5]包新民，舒斯云. 大鼠脑立体定向图谱[M]. 北京：人民卫生出版社， 1991:49?58.

[6]CHOI J Y, SUNG Y M, PARK H J, et al. Rapid purification and analysis of alpha?synuclein proteins: C?terminal truncation promotes the conversion of alpha?synuclein into a protease?sensitive form in Escherichia coli[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2002,36(Pt 1):33?40.

[7]彭湘闽，蒋雨平. 酪氨酸羟化酶与帕金森病[J]. 中国临床神经科学, 2002，10(1)：105?108.

[8]徐岩，孙圣刚，曹学兵，等. 离体帕金森病动物模型制作的研究[J]. 脑与神经疾病杂志, 2002，10(4)：226?227.

[9]李德鹏，徐群渊，张进禄. MPTP处理的小鼠和 6?OHDA损毁的大鼠帕金森病模型病理变化的比较[J]. 中风与神经疾病杂志， 1999，16(2)：79?82.

[10]CROOKE S T, BENNETT C F. Progress in antisense oligonucleotides therapeutics[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 1996,36(1 ):107?129.

[11]AGRAWAL S. Antisense oligonucleotides: towards clinical trials[J]. Trends Biotech, 1996,14(10):376?387.

精品学习网 医药卫生栏目